MỞ ĐẦU

Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới trong năm 2018, bệnh ung thư gan đứng vị trí thứ sáu về số ca mắc mới và đứng thứ tư về số ca tử vong trong số 36 loại ung thư trên thế giới 1. Cụ thể hơn, ung thư gan có hơn 841.000 trường hợp mắc mới và 782.000 trường hợp tử vong trong năm 2018 và được dự đoán sẽ có hơn một triệu ca tử vong do ung thư gan gây ra trong năm 2030 1, 2. Ung thư biểu mô tế bào gan (UTBMTBG) là ung thư gan nguyên phát phổ biến nhất, chiếm hơn 75% tổng số các trường hợp mắc ung thư gan 1. Nhiều yếu tố nguy cơ gây UTBMTBG đã được xác định, trong đó xơ gan do lạm dụng thức uống có cồn, bệnh gan nhiễm mỡ, nhiễm vi rút viêm gan C và D là các yếu tố nguy cơ phổ biến nhất 3, 4. Hiện nay việc chuẩn đoán và phát hiện sớm UTBMTBG còn nhiều hạn chế bởi căn nguyên phức tạp của bệnh này 5. Phần lớn các bệnh nhân được chẩn đoán mắc UTBMTBG ở giai đoạn muộn dẫn đến tỷ lệ sống sót sau 5 năm chỉ 10,1% 6, nếu các bệnh nhân được chẩn đoán ở giai đoạn sớm thì tỷ lệ sống sót sau 5 năm với sự can thiệp của phẫu thuật là >93%7. Như vậy, việc phát hiện sớm UTBMTBG là một yếu tố rất là quan trọng trong việc tăng hiệu quả điều trị và tăng tỷ lệ sống cho bệnh nhân.

Hiện nay, các phương pháp chính trong việc sàng lọc và chẩn đoán UTBMTBG là chẩn đoán hình ảnh (ví dụ: chụp CT hoặc RMI) và xét nghiệm hàm lượng α-fetoprotein (AFP) 8. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều thách thức để phân biệt các UTBMTBG ở giai đoạn sớm với các nốt xơ gan bằng chẩn đoán hình ảnh khi kích thước khối u rất nhỏ (<2cm)9. Mặc dù hàm lượng AFP trong huyết thanh từ lâu đã được sử dụng làm chỉ thị sinh học để sàng lọc và chẩn đoán UTBMTBG, nhưng AFP không phải là dấu ấn sinh học đặc hiệu cho UTBMTBG 10. Gần đây, AFP đã bị loại khỏi các hướng dẫn giám sát UTBMTBG của Hiệp hội Nghiên cứu Bệnh gan Hoa Kỳ do có độ nhạy thấp (độ nhạy chỉ đạt từ 18–60%) 11, 12. Bên cạnh đó, nhiều chỉ thị sinh học khác cũng đã được xác định như: glypican 3 (GPC3), Golgi protein-73 (GP73), descarboxyprothrombin (DCP), glutamic pyruvic transaminase-(GPT) và gamma-glutamyl carboxylase (GGCX) nhưng độ nhạy và độ đặc hiệu ở UTBMTBG vẫn còn nhiều hạn chế, đặc biệt là độ nhạy rất kém ở giai đoạn sớm (khi khối u <2 cm) 13, 14, 15. Do đó, việc tìm kiếm các dấu ấn sinh học mới trong chẩn đoán sớm và tiên lượng chính xác UTBMTBG là rất cần thiết.

Gen SET nuclear proto-oncogene (SET), còn được gọi với các tên khác như I2PP2A, PHAP-II hay TAF- Iβ 16. SET nằm ở nhiễm sắc thể số 9 với kích thước 12.977 bp và sản phẩm protein của SET có kích thước khoảng 39 kDa 17, 18, 19. SET mã hóa cho một protein đa chức năng tham gia vào nhiều quá trình sinh học như: lắp ráp nucleosome, liên kết histone, kiểm soát chu kỳ tế bào, cell migration, phiên mã gen, apoptosis và đặc biệt là tác nhân gây ra các khối u 18, 19, 20. SET là chất ức chế nội sinh mạnh của protein phosphatase 2A (PP2A) 21. Trong khi đó, PP2A là một chất ức chế khối u quan trọng và điều chỉnh nhiều con đường dẫn truyền tín hiệu gây ung thư 22. Điều này chỉ ra rằng, hoạt động gây ung thư của SET có thể được thực hiện bởi việc ức chế PP2A23. Do đó, SET có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy hoặc ngăn chặn sự phát triển của ung thư 20. Để hiểu thêm về các chức năng, cơ chế và sự liên quan của SET với UTBMTBG. Chúng tôi đã tiến hành phân tích mức độ biểu hiện, vai trò và phân bố của gen này trong các mô, cơ quan và tiên lượng trong bệnh nhân UTBMTBG.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

KẾT QUẢ

Sự khác biệt về biểu hiện mRNA và protein SET giữa tế bào ung thư biểu mô gan và mô không ung thư

Cơ sở dữ liệu UALCAN đã được sử dụng để phân tích mức độ biểu hiện mRNA của SET trên các các mẫu mô từ bệnh nhân UTBMTBG và không ung thư thông. Kết quả trong Figure 1 cho thấy, biểu hiện mRNA của SET có sự khác biệt có ý nghĩa (p<0,0001) giữa nhóm bệnh nhận UTBMTBG (TPM trung vị là 62,45) và nhóm không ung thư (TPM trung vị là 40,78).

Về mặt biểu hiện protein, biểu hiện của protein SET trên mẫu mô không ung thư và UTBMTBG có sự khác biệt rõ rệt (Figure 2). Ở mẫu mô không ung thư, hình thái tế bào có sự đồng nhất và có màu nâu nhạt (do mẫu mô có biểu hiện SET thấp, dẫn đến số lượng liên kết giữa SET - kháng thể HPA063683 được hình thành rất ít nên sau khi nhuộm cho kết quả màu nâu nhạt) trên cả nam giới và nữ giới. Ở mẫu mô UTBMTBG, hình thái tế bào không đồng nhất và có màu nâu đậm (do mẫu mô có biểu hiện SET cao dẫn đến số lượng liên kết giữa SET - kháng thể HPA063683 được hình thành rất nhiều nên sau khi nhuộm cho kết quả màu nâu đậm).

Biểu hiện của SET có liên quan đến thời gian sống còn toàn bộ (OS) và sống còn không tái phát (RFS) của bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan

Cơ sở dữ liệu Kaplan-Meier Plotter được dùng để phân tích mối tương quan giữa biểu hiện của SET với sự sống còn và sống còn không tái phát thông qua cơ sở dữ liệu TCGA. Kết quả cho thấy biểu hiện của SET có liên quan có ý nghĩa với sự sống còn (p=3,90e-04; Figure 3A) và sống còn không tái phát (p=4,80e-03; Figure 3B). Nhóm bệnh nhân có biểu hiện gen SET cao có thời gian sống còn và sống còn không tái phát ngắn hơn nhóm biểu hiện thấp.

Tập dữ liệu GSE14520 (n=242) đã được sử dụng để tiến hành phân tích mối tương quan giữa biểu hiện của SET với sự sống còn và sống còn không tái phát của bệnh nhân UTBMTBG. Bệnh nhân được chia thành hai nhóm: nhóm biểu hiện cao (n=121) và nhóm biểu hiện thấp (n=121) dựa vào trung vị mức độ biểu hiện của SET. Dựa vào phân tích Kaplan-Meier cho thấy, biểu hiện SET có liên quan đến sự sống còn của bệnh nhân UTBMTBG (p=6,36e-04; Figure 3C). Bệnh nhân có biểu hiện SET cao có thời gian sống ngắn hơn bệnh nhân có biểu hiện SET thấp. Chúng tôi đã phân tích thêm khía cạnh liên quan của SET với sự sống còn không tái phát và các bước làm được thực hiện tương tự phân tích sự sống còn. Kết quả cho thấy SET cũng liên quan đến sự sống còn không tái phát của bệnh nhân UTBMTBG (p=1,33e-02, Figure 3D) và những bệnh nhân biểu hiện SET cao có thời gian sống còn không tái phát ngắn hơn những bệnh nhân có SET biểu hiện thấp. Nhìn chung, biểu hiện cao của SET liên quan mật thiết đến sự tiên lượng xấu của bệnh UTBMTBG cho cả sự sống còn và sống còn không tái phát.

Biểu hiện của mRNA và protein SET là yếu tố tiên lượng độc lập của ung thư biểu mô tế bào gan

Cơ sở dữ liệu UALCAN đã được dùng để phân tích xác định mối liên hệ giữa mức độ biểu hiện của SET với khả năng sống sót của các bệnh nhân UTBMTBG và không ung thư thông qua các biến như: ung thư và không ung thư, chủng tộc, giới tính, độ tuổi, giai đoạn ung thư và mức độ khối u. Kết quả được trình bày ở Figure 4. Biểu hiện cao của SET không có sự khác biệt giữa giới tính nam và giới tính nữ (Figure 4A). Biểu hiện của SET không có sự khác biệt giữa độ tuổi từ 21 - 40 tuổi so với 41 - 60 tuổi, 61 - 80 tuổi so với 80 - 100 tuổi, 21 - 40 tuổi so với 80 - 100 tuổi, chỉ có sự khác biệt có ý nghĩa giữa 41 - 60 tuổi so với 61 - 80 tuổi (p<0.05) và tất cả các độ tuổi đều có sự khác biệt rất có ý nghĩa so với nhóm không ung thư (p<0,001) (Figure 4B). Biểu hiện của SET không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa người da trắng với người Mỹ gốc phi, người Mỹ gốc phi với người châu Á, chỉ có sự khác biệt có ý nghĩa giữa người da trắng với người châu Á (p<0,02) và tất cả các chủng tộc đều có sự khác biệt rất có ý nghĩa so với nhóm không ung thư (p<0,001) (Figure 4C).

Biểu hiện của SET không có sự khác biệt giữa giai đoạn ung thư 1 với giai đoạn ung thư 2, giai đoạn ung thư 3 với giai đoạn ung thư 4, giai đoạn ung thư 1 với 4, mà chỉ có sự khác biệt giữa giai đoạn ung thư 2 với giai đoạn ung thư 3 (p<0,01). Tất cả các giai đoạn ung thư đều có sự khác biệt có ý nghĩa với nhóm không ung thư (p<0,001), ngoại trừ giai đoạn 4 (Figure 4D) có thể là do số bệnh nhân ở giai đoạn này nhỏ nên không tạo ra sự khác biệt thống kê. Biểu hiện của SET không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa mức độ biệt hóa khối u ở độ 1 với độ 2, độ 3 với độ 4, độ 1 với độ 4 và chỉ có sự khác biệt giữa mức độ biệt hóa khối u ở độ 2 với độ 3 (p<0,001). Tất cả các mức độ biệt hóa khối u đều có sự khác biệt có ý nghĩa với nhóm không ung thư (p<0,001) (Figure 4E).

Ngoài ra, phương pháp kiểm định Chi bình phương đã được thực hiện để nghiên cứu mối quan hệ giữa SET và các thông tin lâm sàng trên hồ sơ dữ liệu GSE14520 (Table 1). Biểu hiện của SET không có mối liên hệ với độ tuổi và giới tính. Sự sống còn và sống còn không tái phát có mối liên quan chặt với biểu hiện SET với mức độ tương ứng là p=2,00e-03, p=4,99e-02.

Biến		Tổng	Biểu hiện cao	Biểu hiện thấp	( χ2-test)
Số bệnh nhân (%)		242	121 (50,0)	121 (50,0)
Tuổi	>50	117 (48,35)	60 (51,28)	57 (48,72)	0,79
	≤50	125 (51,65)	61 (48,80)	64 (51,20)
Giới tính	Nam	211 (87,19)	104 (49,29)	107 (50,71)	0,70
	Nữ	31 (12,81)	17 (54,84)	14 (45,16)
BCLC	0	20 (8,27)	10 (50,00)	10 (50,00)	0,12
	A	152 (62,81)	68 (44,74)	84 (55,26)
		24 (9,92)	11 (45,83)	13 (54,17)
	C	29 (11,98)	20 (68,97)	9 (31,06)
	NA	17 (7,02)	12 (70,59)	5 (29,41)
OS	Sống	146 (60,33)	61 (41,78)	85 (58,22)	2,00e-03
	Chết	96 (69,67)	60 (62,50)	36 (37,50)
RFS	Không tái phát	106 (43,80)	45 (42,45)	61 (57,54)	4,99e-02
	Tái phát	136 (56,20)	76 (55,88)	60 (44,12)

Phương pháp phân tích hồi quy tỷ lệ đơn biến và đa biến Cox đã được thực hiện để tìm các mối tương quan của SET trên hồ sơ GSE14520 (Table 2). Trong phân tích đơn biến thì độ tuổi và giới tính không có mối liên hệ với sự sống còn và sống còn không tái phát. Nhưng sự biểu hiện của SET lại có mối liên hệ chặt với sự sống còn (HR: 0,49; 95% CI: 0,33-0,75; p=8,50e-04) và sống còn không tái phát (HR: 0,65; 95% CI: 0,47 - 0,92; p=0,01). Trong phân tích đa biến thì độ tuổi và giới tính không có mối liên hệ với sự sống còn và sống còn không tái phát. Nhưng sự biểu hiện của SET có mối liên hệ chặt với sự sống còn (HR: 2,49; 95% CI: 0,31 - 0,72; p=4,63e-04) và sống còn không tái phát (HR: 0,62; 95% CI: 0,44-0,88; p=6,65e-03). Từ những kết quả trên cho thấy, SET là một chỉ thị sinh học độc lập và tiềm năng cho việc chẩn đoán sớm và tiên lượng bệnh UTBMTBG.

Biến		Đơn biến			Đa biến
		HR	95% CI	p-value	HR	95% CI	p-value
OS	Tuổi	0,96	0,79 - 1,20	0,69	0,94	0,63 - 1,40	0,76
	Giới tính	1,90	0,90 - 3,80	0,09	1,07	0,98 - 4,20	0,06
	Biểu hiện	0,49	0,33 - 0,75	8,50e-04	2,49	0,31 - 0,72	4,63e-04
RFS	Tuổi	1,00	0,88 - 1,02	0,66	1,15	0,82 - 1,61	0,42
	Giới tính	2,40	1,20 - 5,50	9,00e-03	2,53	1,32 - 4.84	4,77e-03
	Biểu hiện	0,65	0,47 - 0,92	0,01	0,62	0,44 - 0.88	6,65e-03

Phân tích mối tương tác protein – protein của SET

Protein của SET có mối liên hệ gần với protein được mã hóa bởi các gen như: SMC2, NME1, APEX1, GZMA, HMGB2, ANP32A, NUP214, ELAVL1, XPO1và ESR1 (Figure 5).

Phân tích mối liên hệ của SET với các loại tế bào miễn dịch trong UTBMTBG

Sự biểu hiện của SET có sự tương quan có ý nghĩa với tế bào B (p=9,05e-16), tế bào T CD8+ (p=6,10e-18), tế bào T CD4+ (p=1,58e-11), đại thực bào (p= 3,24e-20), bạch cầu trung tính (p=1,13e-18) và tế bào đuôi gai (p=4,19e-25) (Figure 6).

THẢO LUẬN

Ung thư biểu mô tế bào gan là một trong mười loại ung thư phổ biến nhất thế giới, với tỷ lệ mắc mới đang tăng lên từng năm và có tỷ lệ tử vong rất cao1, 30. Nguyên nhân gây ra UTBMTBG rất đa dạng, bị tác động bởi nhiều gen điều khiển khác nhau 31 và việc hình thành khối u UTBMTBG có liên quan đến tăng hoặc giảm hàm lượng các protein khác nhau khiến cho UTBMTBG rất phù hợp với nghiên cứu liên quan đến chỉ thị sinh học 32. Hai phần ba bệnh nhân UTBMTBG được chẩn đoán ở giai đoạn muộn sau khi đã di căn dẫn đến tỷ lệ sống sau 5 năm <10,7% 6. Chẩn đoán sớm và tiên lượng UTBMTBG đã góp phần làm tăng thời gian sống sót của bệnh nhân bằng cách cung cấp các phương pháp điều trị hiệu quả 33, 34. Chỉ thị sinh học UTBMTBG lý tưởng là một chỉ thị cho phép bác sĩ chẩn đoán cho những bệnh nhân không có triệu chứng và có thể được sử dụng rộng rãi trong quá trình sàng lọc35. Mục tiêu của nghiên cứu này là chứng minh SET là một chỉ thị sinh học tiềm năng cho việc chẩn đoán sớm và tiên lượng UTBMTBG.

SET là một oncoprotein đa chức năng có liên quan đến nhiều quá trình trong tế bào 17, 20. Năm 1992, lần đầu tiên SET được xác định với tên là set-can, một gen sinh ung thư giả định liên quan đến sự hình thành bệnh bạch cầu dòng tủy 36. Ở người, SET có 8 exon, nằm ở vị trí q34.11 trên nhiễm sắc thể số 9 và có 2 đồng dạng là SET - α và SET - β 37. Biểu hiện cao của gen SET được chứng minh có liên quan đến sự tiên lượng xấu cho nhiều loại ung thư về cả sự sống còn, sự sống còn khi khối u chưa di căn, sự sống còn không tái phát và sự sống còn không bệnh. Thông qua cơ sở dữ liệu Human Protein Atlas, chúng tôi xác định được sự biểu hiện của SET trong mẫu mô UTBMTBG cao hơn rất nhiều so với mẫu mô không ung thư và sự phát hiện của SET trên mẫu UTBMTBG là 100% (phát hiện 6/6 mẫu mô UTBMTBG được thực hiện hóa mô miễn dịch). Sự biểu hiện của gen SET ở bệnh nhân UTBMTBG cao hơn bệnh nhân không ung thư (1,5-2 lần). Trong phân tích đơn biến, đa biến thông tin lâm sàng của hồ sơ GSE14520 và mối tương quan của SET với thông tin lâm sàng từ cơ sở dữ liệu TCGA, cho thấy SET là một chỉ thị sinh học độc lập cho bệnh UTBMTBG với các biến như tuổi, giới tính và chủng tộc. Đặc biệt, biểu hiện của SET ở nhóm bệnh nhân UTBMTBG giai đoạn 1 (khối u <2 cm, theo hệ thống phân loại ung thư Hoa Kỳ) và mức độ biệt hóa khối u ở độ 1 có sự khác biệt rất có ý nghĩa với nhóm bệnh nhân không ung thư. Sự khác biệt này rất quan trọng trong việc chẩn đoán sớm bệnh UTBMTBG. Mức độ biểu hiện SET không chỉ tương quan với khả năng sống còn mà còn cả sống còn không tái phát. Bệnh nhân UTBMTBG có biểu hiện SET cao có tỷ lệ sống còn và sống còn không tái phát thấp hơn có ý nghĩa so với bệnh nhân UTBMTBG có biểu hiện SET thấp. Sự biểu hiện cao của SET dẫn đến sự tiên lượng xấu cho bệnh nhân UTBMTBG. Những phát hiện này gợi ý rằng sự biểu hiện của SET có thể đóng vai trò như một yếu tố tiên lượng thuận lợi và là một dấu ấn sinh học đầy hứa hẹn để dự đoán sự tái phát trong ung thư biểu mô tế bào gan ở giai đoạn sớm.

Trong phân tích mối quan hệ protein-protein chúng tôi thấy rằng protein của gen SET có mối liên hệ với protein của các gen như XPO1, APEX1, ANP32A, HMGB2 và NME1. SET tương tác trực tiếp với miền aa 25-119 của PP2Ac, từ đó SET đã loại bỏ các chức năng ức chế khối u của PP2A và kích hoạt các tín hiệu ung thư như Akt, Erk, c-Jun, c-Myc, và β-catenine làm thúc đẩy sự tiến triển của các tế bào ung thư 38, 39, 40, 41. Protein XPO1 (exportin 1, còn được gọi là CRM1) là một trong bảy loại exportins và là exportin duy nhất làm trung gian vận chuyển cho nhiều protein ức chế khối u từ nhân ra tế bào chất, trong đó có PP2A 42. Biểu hiện quá mức XPO1 dẫn đến việc nhầm vị trí (miss-localization) của các chất ức chế khối u và các chất điều hòa chu kỳ tế bào, từ đó dẫn đến sự bất hoạt hoặc kích hoạt sai lệch của chúng 43. Sự biểu hiện quá mức của XPO1 có liên quan đến tiên lượng xấu trong ung thư và đề kháng với hóa trị liệu44. Các protein APEX1, ANP32A, HMGB2 và NME1 trong phức hợp SET được ghi nhận là có sự điều chỉnh tăng trong các mô UTBMTBG, chúng là những nhân tố chính trong con đường GzmA (granzyme A-mediated apoptosis). Đặc biệt, sự tăng điều hòa và tích lũy trong nhân tế bào của APEX1 không chỉ liên quan đến bệnh lý ác tính UTBMTBG mà còn với sự biệt hóa của UTBMTBG45. Từ đó cho thấy, các mối liên hệ protein – protein của SET đều liên quan đến sự hình thành các khối u dẫn đến thúc đẩy sự hình thành ung thư. Bên cạnh đó chúng tôi muốn cung cấp thêm một mối tương quan của SET với các tế bào miễn dịch trong UTBMTBG. Độ đồng nhất của mỗi khối u không liên quan đến mức độ biểu hiện SET, cho thấy rằng SET không được biểu hiện cao bởi các tế bào miễn dịch trong vi môi trường khối u, nhưng có nhiều khả năng sẽ biểu hiện quá mức ở các tế bào ung thư. Nghiên cứu đã chứng minh rằng, biểu hiện của của SET tỷ lệ thuận với sự biểu hiện của tế bào B, tế bào T CD8+, T CD4+, đại thực bào, bạch cầu trung tính và đặc biệt là tế bào đuôi gai có sự tương quan mạnh nhất trong tất cả các tế bào miễn dịch được phân tích.

KẾT LUẬN

Nghiên cứu này đã cung cấp một cái nhìn tổng quát hơn về mối tương quan giữa biểu hiện của SET và bệnh ung thư biểu mô tế bào gan. Biểu hiện mRNA của SET trên mẫu mô ung thư biểu mô tế bào gan cao hơn so với trên mẫu mô không ung thư. SET là một chỉ thị sinh học độc lập có thể sử dụng trong chẩn đoán và tiên lượng bệnh ung thư biểu mô tế bào gan. Ở nhóm bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan có biểu hiện SET cao sẽ có thời gian sống còn và sống còn không tái phát ngắn hơn nhóm bệnh nhân có mức độ biểu hiện SET thấp, từ đó cho thấy biểu hiện cao của SET dẫn đến tiên lượng xấu cho bệnh ung thư biểu mô tế bào gan cả về sự sống còn và sống còn không tái phát.

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CT (Computed Tomography): chụp cắt lớp vi tính.

DFS (disease free survival): Sự sống còn không bệnh.

DMFS (Distant Metastasis-Free Survival): Sự sống sót khi khối u chưa di căn.

HR: tỷ lệ rủi ro.

ID (Patient id): Mã số bệnh nhân trong phân tích hóa mô miễn dịch trên cơ sở dữ liệu TCGA.

UTBMTBG (Liver hepatocellular carcinoma): ung thư biểu mô tế bào gan.

MRI (Magnetic resonance imaging): Chụp cộng hưởng từ.

OS (Overall Survival): sự sống còn.

RFS (recurrence-free survival): khả năng sống còn không tái phát.

SET (SET nuclear proto-oncogene): gen SET nuclear proto-oncogene.

XUNG ĐỘT LỢI ÍCH

Nhóm tác giả cam kết rằng không có xung đột lợi ích khi thực hiện nghiên cứu này.

ĐÓNG GÓP CỦA CÁC TÁC GIẢ

Tất cả tác giả có đóng góp vào việc thiết kế nội dung nghiên cứu, giải thích kết quả nghiên cứu, viết bài báo, chỉnh sửa bài báo, xem xét cẩn thận và đồng ý nộp bài báo hoàn chỉnh này.

ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU YSINH

Nghiên cứu không can thiệp quá trình điều trị và không sử dụng mẫu từ bệnh nhân.

LỜI CẢM ƠN

Nghiên cứu được tài trợ bởi Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh (ĐHQG-HCM) trong khuân khổ Đề tài mã số C2021-44-02.