Hóa chất, trang thiết bị và đối tượng nghiên cứu

Hoá chất

Chất đối chiếu Acid gallic (GA, Sigma-Aldrich, Số lô: SLCB 2701, hàm lượng: 97,5-102,5%), Quercetin (Viện kiểm nghiệm thuốc TP.HCM, Số lô: QT104 140520, hàm lượng: 95,8%, Acid ascorbic (Xilong Scientific, Số lô: 190516 2, hàm lượng ≥ 99,7%), Doxorubicin (Merck), Dimethyl sulfoxide (DMSO, Merck), Thuốc thử Folin-Ciocalteu pha sẵn (Merck), Aluminium chloride hexahydrate (Xilong Scientific), Sodium carbonate anhydrous (Xilong Scientific), Methanol (Xilong Scientific), 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH, Sigma-Aldrich), Môi trường Eagle sửa đổi của Dulbecco (DMEM, Sigma-Aldrich), MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (Sigma-Aldrich).

Thiết bị

Dụng cụ: Pipette bầu (Brand, Đức), Bình định mức (Brand, Đức), Micropipette (Eppendorf, Đức).

Thiết bị: Cân phân tích ABS220-4N (Kern, Philippines), Máy quang phổ UV-Vis Shimadzu UV 1800 (Nhật Bản), Máy cô quay chân không Stuart RE300 (Anh), Máy đo quang phổ và độ hấp thụ Multiskan Ascent (Thermo Scientific, Mỹ), Tủ ấm CO (NuAire, Mỹ).

Đối tượng nghiên cứu

• Thần xạ hương (Luvunga scandens họ Cam Rutaceae).

• É lớn tròng (Hyptis suaveolens (L.) Poit. họ Hoa môi Lamiaceae).

• Cà dại hoa trắng (Solanum torvum Sw. họ Cà Solanaceae).

• Gừng gió (Zingiber zerumbet (L.) Roscoe ex Sm. họ Gừng Zingiberaceae).

• Tế bào ung thư gan HepG2.

Phương pháp nghiên cứu

Chuẩn bị cao chiết

Các mẫu Lá thần xạ hương (RLD1), Thân rễ gừng gió (RLD7R), Rễ é lớn tròng (RLD9) và Lá cà dại hoa trắng (RLD10) được các tác giả thu hái ở huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang vào tháng 10/2019. Mẫu dược liệu được định danh theo hệ thống phân loại của Phạm Hoàng Hộ, 2003. Mẫu sau khi thu thập rửa sạch, để ráo, cắt nhỏ và sấy ở 50 ℃ trong vòng 7 ngày để khô hoàn toàn. Mẫu sau đó được nghiền nhỏ, rây đều bằng rây inox 1 mm. Cân 20 g mẫu đã rây, ngâm trong methanol trong 3 ngày. Lọc thu lấy dịch lọc, thu hồi methanol bằng máy cô quay chân không để thu được cao methanol tương ứng với các dược liệu chiết.

Hiệu quả kháng tế bào ung thư gan HepG2

Tế bào ung thư gan HepG2 được cung cấp bởi Trung tâm nghiên cứu và thu thập nguồn sinh học (Bioresource Collection and Research Center-BCRC, Hsinchu, Taiwan). Tất cả các tế bào được duy trì trong môi trường Eagle sửa đổi của Dulbecco (DMEM) và được bổ sung 10% huyết thanh thai bò (FBS-Gibco). Tế bào được nuôi ở 37 °C, 5% CO.

1×10 tế bào HepG2 được gieo vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng. Cao chiết pha loãng trong DMSO thành nồng độ 100 mg/L được thêm vào, ủ trong 48 tiếng. Môi trường nuôi cấy sau đó được thay bằng môi trường với MTT có nồng độ cuối là 0,5 mg/mL và tiếp tục ủ trong 4 tiếng. Máy đo quang phổ và độ hấp thụ Multiskan Ascent được dùng để xác định các tinh thể formazan hoà tan trong DMSO ở bước sóng 550 nm7, 8. Phần trăm tế bào sống sót được tính theo công thức:

% Tế bào sống sót (%TBSS) = ODtest/ODcontrol × 100%

Mỗi thí nghiệm được thực hiện 3 lần nhằm xác định %TBSS quy về giá trị trung bình ± sai số chuẩn. Các tế bào được xử lý với một dãy nồng độ pha loãng của Doxorubicin từ 0,5-5,0 µM trong 48 tiếng làm mẫu đối chứng dương và tính toán giá trị IC của Doxorubicin đối với HepG2.

Hiệu quả chống oxy hoá

Hoạt tính chống oxy hoá của cao chiết được đánh giá thông qua khả năng trung hoà gốc DPPH9. Các mẫu chiết được pha thành các dải nồng độ khác nhau trong methanol, cụ thể: RLD1 (150-550 mg/L), RLD7R (10-50 mg/L), RLD9 (10-30 mg/L), RLD10 (150-550 mg/L). Sau đó, lần lượt thêm vào 1,1 mL dung dịch DPPH 0,2 mM trong methanol và methanol sao cho hỗn hợp phản ứng có thể tích 3 mL. Hỗn hợp được giữ trong tối ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Song song với mỗi mẫu chiết, tiến hành chuẩn bị mẫu đối chứng là mẫu với cùng điều kiện nhưng không có dung dịch mẫu chiết. Độ hấp thụ của các mẫu được đo ở bước sóng 516 nm ứng với đỉnh hấp thu cực đại bằng máy quang phổ UV-Vis Shimadzu UV 1800 với mẫu trắng là methanol. Mỗi mẫu được chuẩn bị và đo 3 lần.

Hoạt tính khử gốc tự do DPPH được đánh giá thông qua giá trị phần trăm loại bỏ SC% và được tính theo công thức:

Trong đó: SC%: phần trăm loại bỏ gốc tự do DPPH, Ac: Độ hấp thu của mẫu đối chứng, At: Độ hấp thu của mẫu thử.

Tác dụng chống oxy hóa của mẫu chiết được so sánh với chất chuẩn là Acid ascorbic. Giá trị IC của các mẫu chiết được tính tại điểm dập tắt 50% gốc tự do DPPH dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính tương ứng.

Xác định hàm lượng flavonoid toàn phần

Hàm lượng flavonoid toàn phần được xác định theo phương pháp so màu phức nhôm-flavonoid của Christ và Müller, 1960 có hiệu chỉnh10. Nghiên cứu của Pękal và Pyrzynska (2014) về sau cho thấy việc bổ sung muối acetat (ở dạng CHCOOK hoặc CHCOONH) là không cần thiết vì khi có và không có chúng, các giá trị của độ hấp thụ là tương tự nhau11. Đường chuẩn được chuẩn bị bằng cách hút chính xác 0,4 mL; 0,8 mL; 1,6 mL; 2,4 mL; 3,2 mL và 4,0 mL dung dịch chuẩn Quercetin 250 mg/L trong methanol vào các bình định mức 20 mL. Thêm 2,5 mL AlCl 8% vào bình và lắc nhẹ sau đó định mức lên đến vạch bằng nước cất. Các mẫu trắng được chuẩn bị tương tự, nhưng dung dịch AlCl 8% được thay bằng lượng nước cất tương đương. Hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và sau đó các dung dịch được đo độ hấp thụ bằng máy quang phổ UV-Vis Shimadzu UV 1800 ở bước sóng 429 nm. Mỗi mẫu chuẩn bị được đo 3 lần.

Hút chính xác 3 mL; 5 mL; 7 mL và 9 mL dung dịch cao chiết có nồng độ 1000 mg/L vào các bình định mức 20 mL. Các bước tiếp theo thực hiện tương tự như khi xây dựng đường chuẩn. Các dung dịch chứa mẫu cao chiết được đo độ hấp thụ để xác định nồng độ. Các mẫu RLD1, RLD9, RLD10 được xác định với dãy nồng độ 150-450 mg/L, riêng mẫu RLD7R, dãy nồng độ được giảm xuống 25-100 mg/L. Hàm lượng flavonoid toàn phần được biểu diễn tương đương mg QE/g cao chiết theo công thức:

Trong đó: F: Hàm lượng flavonoid toàn phần (mg QE/g cao chiết), a: giá trị từ đường chuẩn với Quercetin (mg/L), V: thể tích dung dịch cao chiết (L), m: khối lượng cao chiết có trong thể tích V (g).

Xác định hàm lượng phenol toàn phần

Hàm lượng phenol toàn phần được xác định bằng phương pháp Folin-Ciocalteu12. Phương pháp này dựa trên sự khử hoá của thuốc thử Folin-Ciocalteu với các nhóm hydroxy phenol tạo nên sản phẩm khử có màu xanh lam. Đường chuẩn được xây dựng bằng cách lấy chính xác 0,5 mL dung dịch chuẩn GA (khoảng nồng độ 50-1000 mg/L) cho vào các bình định mức 20 mL. Thêm vào mỗi bình 10 mL nước cất và 1 mL thuốc thử Folin-Ciocalteu. Lắc đều và ủ trong bóng tối ở nhiệt độ phòng trong vòng 6 phút. Thêm vào mỗi bình 3 mL dung dịch NaCO 20% và định mức đến đúng thể tích bằng nước cất. Hỗn hợp được lắc đều và ủ trong bóng tối ở nhiệt độ phòng trong vòng 2 giờ. Sau đó các dung dịch được đo độ hấp thụ bằng máy quang phổ UV-Vis Shimadzu UV 1800 ở bước sóng 751 nm với mẫu trắng là hỗn hợp của 1 mL thuốc thử Folin-Ciocalteu, 3 mL NaCO 20% và được định mức đến 20 mL bằng nước cất. Mỗi mẫu chuẩn bị được đo 3 lần.

Hút chính xác 0,5 mL; 1,5 mL; 2,5 mL; 3,5 mL và 4,5 mL dung dịch cao chiết với nồng độ 2000 mg/L vào các bình định mức 20 mL. Các bước tiếp theo thực hiện tương tự như khi xây dựng đường chuẩn. Các dung dịch chứa mẫu cao chiết được đo độ hấp thụ để xác định nồng độ phenol toàn phần, được biểu diễn tương đương mg GAE/g cao chiết theo công thức:

Trong đó P: Hàm lượng phenol toàn phần (mg GAE/g cao chiết), a: giá trị từ đường chuẩn với Acid gallic (mg/L), V: thể tích dung dịch cao chiết (L), m: khối lượng cao chiết có trong thể tích V (g).

Hiệu suất chiết các mẫu dược liệu

Từ kết quả bảng 1, hiệu suất chiết cao nhất là mẫu RLD7R (31,45%), giá trị này gấp 1,22 lần RLD1 (25,70%), 2,28 lần so với RLD10 (13,80%) và gấp 4,80 lần mẫu có hiệu suất chiết thấp nhất là RLD9 (6,60%).

Hiệu quả kháng tế bào ung thư gan HepG2

Hiệu quả kháng tế bào ung thư gan HepG2 của 4 loại cao chiết được trình bày trong Bảng 2.

Theo kết quả từ bảng 2, ở nồng độ cao chiết 100 mg/L, khả năng kháng tế bào ung thư gan HepG2 cao nhất ở lá thần xạ hương (RLD1) và rễ é lớn tròng (RLD9) với % tế bào HepG2 sống sót lần lượt là 26,65 ± 0,70% và 26,16 ± 1,76%. Lá cà dại hoa trắng (RLD10) kháng tế bào ung thư gan HepG2 thấp với %TBSS tế bào là 75,33 ± 1,56, gấp gần 3 lần so với mẫu RLD1 và RLD9. Thân rễ gừng gió (RLD7R) không kháng tế bào ung thư HepG2. Giá trị IC của Doxorubicin đối với HepG2 là 1,67 ± 0,33 μM.

Khả năng chống oxy hoá

Sau khi tính toán giá trị SC% của các mẫu chiết, khả năng chống oxy hoá của các cao chiết được thể hiện trong bảng 3.

Kết quả trình bày trong bảng 3 cho thấy RLD7R chống oxy hoá mạnh nhất (IC là 21,326 ± 0,083 mg/L), khả năng chống oxy hoá tương đương ở RLD9 (IC là 24,320 ± 0,031 mg/L). Mẫu RLD1 và RLD10 không thể hiện khả năng chống oxy hoá (IC lần lượt là 426,275 ± 0,005 mg/L và 541,104 ± 0,002 mg/L).

Xác định hàm lượng toàn phần flavonoid và phenol

Kết quả định lượng flavonoid và phenol toàn phần được trình bày trong bảng 4.

Theo kết quả trong bảng 4, hàm lượng flavonoid toàn phần của cao chiết RLD7R cao nhất trong các mẫu cao chiết (63,13 ± 14,30 mg QE/g cao chiết), gấp 1,7 lần so với RLD1 (38,11 ± 13,29 mg QE/g cao chiết), 5,3 lần so với RLD9 (12,52 ± 3,14 mg QE/g cao chiết) và 6,4 lần so với mẫu có hàm lượng thấp nhất là RLD10 (9,85 ± 0,94 mg QE/g cao chiết).

Hàm lượng phenol toàn phần của cao chiết RLD9 cao nhất trong các mẫu cao chiết (97,44 ± 1,46 mg GAE/g cao chiết), giá trị này gấp 1,8 lần mẫu RLD7R. Hai mẫu có hàm lượng phenol toàn phần thấp hơn là RLD10 (25,04 ± 2,09 mg GAE/g cao chiết), thấp hơn gần 4,0 lần so với RLD9 và RLD1 (17,44 ± 0,71 mg GAE/g cao chiết), thấp hơn 5,6 lần so với RLD9.

Hiệu quả kháng tế bào ung thư gan HepG2

Mặc dù lá thần xạ hương vốn đã được sử dụng từ lâu để trị bệnh gan nhưng nghiên cứu về khả năng kháng tế bào ung thư gan HepG2 chưa được đầy đủ14, nghiên cứu của Al-Zikri và cộng sự thì thân và lá loài này chỉ có khả năng gây độc tế bào ung thư biểu mô vú MCF-715. Tương tự như lá thần xạ hương, cây é lớn tròng thường dùng trong dân gian để chữa cảm sốt và có khả năng kháng khuẩn tốt16. É lớn tròng đã được đánh giá tính gây độc trên tế bào ung thư biểu mô cổ trướng Ehrlich (EAC) và kháng mạnh với EAC do kích hoạt sự chết theo chương trình của tế bào17. Tuy nhiên, vẫn chưa có nhiều nghiên cứu khai thác khả năng kháng tế bào ung thư gan HepG2 trên hai loại dược liệu này. Từ kết quả khảo sát hoạt tính trên cho thấy trong 4 loài dược liệu thì lá thần xạ hương (RLD1) và rễ é lớn tròng (RLD9) có hoạt tính kháng tế bào ung thư gan HepG2 mạnh nhất. Ngoài ra, khả năng kháng tế bào ung thư gan HepG2 của lá loài RLD10 có hoạt tính yếu. Nghiên cứu của Lu và cộng sự, 2009 đã tìm ra 2 hợp chất glycosid là torvosid M, torvosid N và nghiên cứu của Viet Cuong và cộng sự, 2020 cũng tìm ra 4 hoạt chất steroid glycosid từ các bộ phận trên mặt đất của cà dại hoa trắng có hoạt tính kháng HepG218, 19. Điều này cho thấy ở phần lá, các hoạt chất có khả năng kháng tế bào HepG2 có hàm lượng thấp so với các bộ phận khác như quả và thân. RLD7R hầu như không cho thấy khả năng kháng tế bào HepG2. Theo các nghiên cứu trước đây, RLD7R chủ yếu chứa tinh dầu, thành phần chủ yếu là zerumbon (75,2%) với hiệu suất chiết tinh dầu là 0,12%20. Trong nghiên cứu của Sakinah, Handayani và cộng sự, 2007 đã chứng minh hoạt chất zerumbon có khả năng gây độc trên HepG2 với IC là 3,45 ± 0,026 mg/L21. Tuy nhiên trong thử nghiệm thì mẫu cao chiết RLD7R hầu như không kháng tế bào HepG2. Điều này có thể giải thích do hiệu suất chiết zerumbon rất thấp, và ở nồng độ khảo sát của cao toàn phần hàm lượng zerumbon không đáng kể nên không cho thấy khả năng kháng HepG2.

Khả năng chống oxy hoá

Cao chiết RLD7R chống oxy hoá mạnh nhất (IC là 21,326 ± 0,083 mg/L). Giá trị IC RLD7R thấp hơn gần 20 lần so với kết quả của Nag và cộng sự, 2013 chiết xuất bằng ethanol với IC là 417,14 mg/L22. Ngược lại, tinh dầu RLD7R cho kết quả khả năng chống oxy hoá rất mạnh với IC là 1,60 mg/L20. Sự khác biệt giá trị IC do thành phần mẫu thu được phụ thuộc vào chất lượng mẫu đầu vào, phương pháp chiết xuất, đặc biệt là dung môi chiết xuất. Các nghiên cứu cũng cho thấy các hợp chất có tính chống oxy hoá, điển hình như hợp chất phenol tan tốt trong methanol hơn so với ethanol. Ngược lại với RLD7R là RLD1 có khả năng chống oxy hoá rất thấp. Thử nghiệm khả năng chống oxy trên tinh dầu của quả thần xạ hương cho kết quả IC là 3,61 mg/L17. Trong chiết xuất thân và rễ của thần xạ hương, Sirinut và cộng sự, 2017 đã phân lập được các hợp chất Isobutylglucosinolat có hoạt tính chống oxy hoá cao (IC là 30,1 ± 0,2 mg/L)23. Như vậy, lá thần xạ hương có khả năng chống oxy hoá mạnh tương đương các bộ phận khác. Tương tự như RLD1, cao chiết RLD10 cũng không thể hiện khả năng chống oxy hoá (IC là 541,1040 ± 0,0024 mg/L). Giá trị này phù hợp với nghiên cứu của Acheampong và cộng sự, 2016 với IC là 416,8 mg/L trong cùng điều kiện thí nghiệm và cao hơn mẫu chiết quả cà dại hoa trắng chiết xuất bằng ethanol với IC là 180 mg/L Waghulde, Kamble và cộng sự, 201124, 25. RLD9 là một trong những cao chiết chống oxy hoá mạnh (IC là 24,320 ± 0,031 mg/L), chỉ sau RLD7R. Giá trị IC này tương đương với thử nghiệm của Alok và cộng sự, 2010 trên lá é lớn tròng chiết xuất methanol với IC là 24,56 mg/L26. Hiện chưa có thử nghiệm khả năng chống oxy hoá của rễ é lớn tròng. Tuy nhiên các kết quả đều ủng hộ rằng các bộ phận của é lớn tròng đều có khả năng chống oxy hoá mạnh và tương đương nhau27.

Hàm lượng toàn phần flavonoid và phenol

Theo kết quả trong bảng 4, hàm lượng flavonoid cao nhất ở RLD7R (63,13 ± 14,30 mg QE/g cao chiết). Theo Ali Ghasemzadeh và cộng sự, 2016, hàm lượng flavonoid ở thân rễ gừng gió là 29,7 ± 4,11 mg QE/g cao chiết, giá trị này thấp hơn 2 lần so với kết quả của nghiên cứu28. Thần xạ hương có hàm lượng flavonoid thấp hơn 1,7 lần so với thân rễ gừng gió. É lớn tròng có hàm lượng flavonoid thấp hơn 5,3 lần so với mẫu RLD7R. Ghafari H, Ghassam BJ và cộng sự, 2014 đã chiết xuất các bộ phận trên mặt đất của é lớn tròng bằng methanol và xác định hàm lượng flavonoid toàn phần là 28,58 ± 1,74 mg QE/g cao chiết, cao hơn 2 lần so với kết quả nhóm nghiên cứu29. Khi nghiên cứu về mối liên hệ giữa các thành phần hoá học trong dược liệu với tính chống oxy hoá, Heim và cộng sự, 2002 đã chứng minh flavonoid có khả năng chống oxy hoá tốt30. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, hàm lượng flavonoid cao không ảnh hưởng đến khả năng kháng oxy hoá.

Có thể thấy hai cao chiết có nồng độ phenol toàn phần cao nhất (RLD9 là 97,44 ± 1,46 mg GAE/g cao chiết và RLD7R là 53,39 ± 4,98 mg GAE/g cao chiết), khả năng chống oxy hoá tương ứng cũng mạnh nhất (IC của RLD7R là 21,326 ± 0,083 mg/L và RLD9 là 24,320 ± 0,031 mg/L). Nghiên cứu của Ghafari H và Ghassam BJ, 2014 cho thấy khi chiết tất cả bộ phận trên mặt đất của é lớn tròng bằng methanol thu được hàm lượng phenol toàn phần (74,56 ± 1,33 mg GAE/g cao chiết) thấp hơn 1,3 lần so với kết quả của nghiên cứu29. Ở cây gừng gió, Akinola và cộng sự, 2014, chiết xuất bằng methanol, hàm lượng phenol toàn phần được xác định vào khoảng 6 mg GAE/g cao chiết31. Trong khi đó, hàm lượng phenol toàn phần của RLD7R là 53,39 ± 4,98 mg GAE/g cao chiết, là một trong hai dược liệu có hàm lượng phenol toàn phần cao nhất trong 4 loài khảo sát. Lá cà dại hoa trắng có hàm lượng phenol toàn phần thấp hơn thân rễ gừng gió. Trong nghiên cứu của Djoueudam FG và cộng sự, 2019 chiết xuất lá cà dại hoa trắng bằng ethanol, hàm lượng phenol toàn phần là 29,64 ± 0,59 mg GAE/g cao chiết, tương đương với hàm lượng mẫu RLD10 dù khác hệ dung môi chiết xuất32. Giá trị này cũng tương đương với nghiên cứu Abdulkadir và cộng sự, 2016 với hàm lượng phenol toàn phần là 37,48 ± 0,41 mg GAE/g cao chiết từ lá trong methanol33. Nghiên cứu khác của Waghulde, Kamble và cộng sự, 2011 chiết xuất quả cà dại hoa trắng bằng dung môi ethanol cho kết quả hàm lượng phenol là 99,52 ± 0,42 mg GAE/g cao chiết, cao gấp 4 lần hàm lượng ở lá. Thần xạ hương có hàm lượng phenol thấp nhất trong bốn mẫu dược liệu. Hàm lượng flavonoid toàn phần cho thấy mối tương quan với hoạt tính gây độc tế bào HepG2, trong khi đó hàm lượng phenol toàn phần tỉ lệ thuận với hoạt tính chống oxy hoá.